PI 凋亡檢測(cè)試劑盒操作詳情
產(chǎn)品說(shuō)明：
細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的基本特征之一，在機(jī)體的胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定等方面都起到十分重要的作用。Annexin V 是一種分子量為 35.8 KD 的 Ca2+依賴(lài)性磷脂結(jié)合蛋白，能與細(xì)胞凋亡過(guò)程中翻轉(zhuǎn)到膜外的磷脂酰絲胺酸（Phosphatidylserine, PS）高親和力特異結(jié)合。FITC-Annexin V 結(jié)合到凋亡細(xì)胞后，在藍(lán)色光的激發(fā)下，發(fā)出綠色熒光，區(qū)分出凋亡細(xì)胞與正常細(xì)胞。dian化丙啶（Propidium iodide，PI）是一種核酸染料，它不能穿透完整細(xì)胞膜，但對(duì)凋亡晚期細(xì)胞和死細(xì)胞的破損細(xì)胞膜能夠穿透，并使細(xì)胞核紅染。將 FITC-Annexin V 與 PI 匹配使用，可以將凋亡早期的細(xì)胞和晚期的細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。
操作方法：
1、 用 27ml 的去離子水稀釋 3ml Binding Buffer（10×）至 30ml，每次用 3ml。
2、 收集細(xì)胞（1×106 個(gè)/次），然后用冷的 PBS 洗滌。（對(duì)于貼壁細(xì)胞，先用胰酶消化，再用 PBS 洗滌）。
3、 用 1ml 1×的 Binding Buffer 懸浮細(xì)胞，300×g 離心 10min，棄上清。
4、 用 1ml 1×的 Binding Buffer 重懸細(xì)胞，使細(xì)胞的密度達(dá)到 1×106 個(gè)/ml。
5、 每管加入 100μL 細(xì)胞（1×105 個(gè)）。
6、 再向管中加入 5μL Annexin V-FITC。
7、 室溫，避光，輕輕地混勻，10min。
8、 加入 5μL PI，室溫，避光，孵育 5min。
9、 加入 PBS 至 500μL，輕輕混勻。
10、在 1 小時(shí)內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。1、 用 27ml 的去離子水稀釋 3ml Binding Buffer（10×）至 30ml，每次用 3ml。
2、 收集細(xì)胞（1×106 個(gè)/次），然后用冷的 PBS 洗滌。（對(duì)于貼壁細(xì)胞，先用胰酶消化，再用 PBS 洗滌）。
3、 用 1ml 1×的 Binding Buffer 懸浮細(xì)胞，300×g 離心 10min，棄上清。
4、 用 1ml 1×的 Binding Buffer 重懸細(xì)胞，使細(xì)胞的密度達(dá)到 1×106 個(gè)/ml。
5、 每管加入 100μL 細(xì)胞（1×105 個(gè)）。
6、 再向管中加入 5μL Annexin V-FITC。
7、 室溫，避光，輕輕地混勻，10min。
8、 加入 5μL PI，室溫，避光，孵育 5min。
9、 加入 PBS 至 500μL，輕輕混勻。
10、在 1 小時(shí)內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
注意事項(xiàng)：
1、旋帽離心管裝的試劑在開(kāi)蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開(kāi)蓋時(shí)液體灑落。
2、Annexin V-FITC 和 Propidium iodide 是光敏物質(zhì)，在保存與操作時(shí)請(qǐng)注意避光。
3、Propidium iodide（PI）能通過(guò)皮膚吸收，對(duì)眼睛有刺激作用。
4、在細(xì)胞洗滌的zui后一步，請(qǐng)盡量將上清棄凈，以免 PBS 殘留影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果
5、PI 染色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)有可能造成檢測(cè)的凋亡率偏高，建議首行 Annexin V-FITC 染色，上機(jī)前 5分鐘再加入 PI 染色。
6、整個(gè)操作過(guò)程動(dòng)作要盡量輕柔，勿用力吹打細(xì)胞，盡量在 4℃下操作。
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