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南京信帆生物:DNA分子的限制性內切酶消化操作流程
更新時間:2016-04-20   點擊次數:1487次

 

一、限制性內切酶對DNA消化的方案

1.限制性內切酶反應在滅菌的0.5ml離心管中進行。

2. 20μl體積反應體系如下:

DNA 0.2-1 μg

10×酶切buffer 2.0 μl

限制性內切酶 1-2 u(單位)

加ddH2O 至 20 μl

限制性內切酶zui后加入,輕輕混勻,稍加離心,放置于zui適溫度水浴并按所需的時間溫育,一般為37℃水浴消化3hr。

3.用于回收酶切片段時,反應總體積可達50-200μl,各反應組分需相應增加。

4.多種酶消化時若緩沖液條件相同,可同時加入;否則,先做低溫或低鹽的酶消化,再做高溫或高鹽的酶消化。

5.酶切結束時,加入0.5M EDTA(pH 8.0)使終濃度達10mM,以終止反應。或將反應管在65℃水浴放置10min以滅活限制性內切酶活性。

6.如消化反應體積過大,電泳時加樣孔盛不下,可加以濃縮:終止反應后,加入0.6體積的5M乙酸銨(或1/10體積3M NaAc)和2倍體積無水乙醇,在冰上放置5min,然后于4℃離心12000g× 5min。傾去含大部分蛋白質的上清液。于室溫晾干DNA沉淀后溶于適量TE中(pH 7.6)。

7.如要純化消化后的DNA,可用等體積酚/氯仿(1∶1)和氯仿各抽提一次,再用乙醇沉淀。

二、電泳檢測

取質粒酶切產物適量,加適當loading buffer混勻上樣,以未經酶切的質粒或/和酶切的空載體(如有)作對照,采用 1-5V/cm的電壓,使DNA分子從負極向正極移動,至合適位置取出置紫外燈下檢測,攝片。

三、注意事項

1. 濃縮的限制性內切酶可在使用前以1×限制酶緩沖液稀釋,切勿用水稀釋以免酶變性。

2. 購買的限制性內切酶多保存于50%甘油中,于-20℃是穩定的。進行酶切消化時,將除酶以外的所有反應成分加入后即混勻,再從-20℃冰箱中取出酶,立即放置于冰上。每次取酶時都應更換一個無菌吸頭,以免酶被污染。加酶的操作盡可能快,用完后立即將酶放回-20℃冰箱。

3.盡量減少反應體積,但要確保酶體積不超過反應總體積的10%,否則酶活性將受到甘油的抑制。

4.通常延長時間可使所需的酶量減少,在切割大量DNA時可用。在消化過程中可取少量反應液進行微量凝膠電泳以檢測消化進程。

5.注意星號酶切活力。

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